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Pourquoi utiliser des anticorps dirigés contre la CLDN18 pour détecter la CLDN18,2 dans les échantillons de tumeurs de l’estomac et de la JOG?
Les anticorps dirigés contre la CLDN18 reconnaissent les deux isoformes de la CLDN18 : la CLDN18,1 et la CLDN18,2. Néanmoins, lorsque du tissu prélevé sur une tumeur de l’estomac ou de la JOG est analysé, la coloration est attribuée à la présence de CLDN18,2, car2,3:
- la CLDN18,1 est exprimée principalement dans le tissu adénocarcinomateux pulmonaire et elle n’est pas détectable dans les cancers de l’estomac ou de la JOG3;
- la CLDN18,2 est normalement présente dans l’épithélium gastrique et elle est souvent préservée dans le tissu cancéreux de l’estomac3.
Préparation des échantillons et pré-analyse
La manipulation et la préparation adéquates des prélèvements sont primordiales pour obtenir des résultats exacts d’analyse de biomarqueurs1.
Préparer les échantillons d’analyse de la CLDN18,2
Takeshi Kuwata, M.D., Ph. D.
Préparation des échantillons
Selon les pratiques recommandées, un entretien quotidien du préparateur de tissu devrait être effectué conformément aux directives du fabricant. Une vérification rigoureuse de la qualité des liquides du préparateur devrait aussi être faite. Il faut notamment surveiller le pH et la pureté du formol ainsi que la contamination des alcools par l’eau1.
Durée maximale d’ischémie froide
La durée d’ischémie froide ne devrait pas dépasser 60 minutes, selon les recommandations actuelles1.
Fixation
Il faut suivre les pratiques recommandées en ce qui concerne les variables et la durée de fixation des échantillons1.
Principales variables1
Le tissu doit être complètement immergé dans le fixateur.
L’épaisseur du prélèvement ne doit pas dépasser 4 ou 5 mm.
Le ratio du volume du fixateur par rapport à la masse du tissu doit être d’au moins 4:1 (le ratio optimal est de 10:1).
La paraffine doit être fondue à moins de 60 °C.
Le prélèvement doit être composé d’une quantité suffisante de tissu tumoral pour procéder à l’analyse.
Principales considérations de durée1
Le tissu doit être fixé dans une solution de formol neutre à 10 % tamponné au phosphate (pH de 7,0) pendant au moins 6 heures et au plus 24 à 36 heures.
Toutefois, si le tissu a une forte teneur en graisses, sa fixation pourrait prendre jusqu’à 48 heures.
Fixation non optimale du tissu1
Les variables pré-analytiques doivent absolument être optimisées pour amoindrir le plus possible la formation d’artéfacts de coloration susceptibles de fausser les résultats d’analyse.
Bouffée de contraste cytoplasmique provoquée par une fixation non optimale susceptible de fausser les résultats d’analyse de la membrane.
Préparation des échantillons2
Les tissus fixés au formol et enrobés dans la paraffine en pratique courante conviennent aux analyses d’IHC.
Les échantillons obtenus d’une biopsie par aspiration à l’aiguille, les échantillons cytologiques et les lésions osseuses métastatiques ne sont pas admissibles aux tests de coloration de la CLDN18.
Les coupes tissulaires peuvent être sectionnées à une épaisseur d’environ 4 µm (min. 3 µm; max. 6 µm*).
Avant leur coloration, les coupes doivent être séchées complètement à température de laboratoire (séchage à l’air) ou au four à 60 °C pendant 60 minutes*.
*Condition propre à l’analyse de la CLDN18.
Conditions de conservation1
Pour garder les prélèvements en bon état, les conditions suivantes doivent être respectées dans les lieux de conservation:
Air sec
Absence de parasites
Température de laboratoire (18 °C à 25 °C)
Analyses
Possibilités d’IHC pour évaluer l’expression de la CLDN18,2
Il existe plusieurs tests, anticorps et appareils pour évaluer l’expression de la CLDN18,2. Parmi les tests et les anticorps figurent le test VENTANA CLDN18 (43-14A) Assay pour diagnostic in vitro, l’anticorps anti-CLDN18 PathPlusTM de LSBio et l’anticorps recombiné anti-claudine 18 (43-14A) d’Abcam. Du côté des appareils, on retrouve les systèmes de coloration BenchMark ULTRA, Autostainer de Dako et Bond de Leica4.
Cette liste des tests, anticorps et appareils n’est pas exhaustive. De plus, les tests diagnostiques compagnons susmentionnés n’ont pas été approuvés par la FDA pour le moment.
VENTANA CLDN18
(43-14A) Assay pour diagnostic in vitroApprenez-en plus
Anticorps anti-CLDN18 PathPlusTM
de LSBioApprenez-en plus
Anticorps recombiné anti-claudine 18 (43-14A) d’AbcamApprenez-en plus
Détecter la CLDN18,2
Christoph Röcken, M.D.
Sélection des échantillons témoins adéquats
Il est essentiel d’utiliser les bons échantillons témoins pour détecter la CLDN18,2 dans les tumeurs prélevées de l’estomac et de la JOG. Voici quelques points centraux à considérer pour leur sélection et leur utilisation2,5.
Validation des analyses au moyen d’échantillons témoins
Conformément aux lignes directrices, les laboratoires devraient valider ou vérifier les analyses d’IHC grâce à des tests qui correspondent à l’utilisation prévue de la méthode d’analyse réalisés avec des échantillons témoins positifs et négatifs et une pièce de tissu limite5.
Différents fournisseurs offrent des échantillons témoins pour les analyses de tissus:
Réalisation des tests de contrôle
- Il est recommandé d’effectuer les meilleurs tests de contrôle possible, notamment au moyen de témoins positifs et négatifs2.
- Le tissu gastro-intestinal métaplasique est un bon exemple de témoin positif et négatif approprié, car2:
- la membrane de ses cellules épithéliales gastriques saines subit une forte coloration;
- la membrane de ses cellules épithéliales situées dans les zones de métaplasie subit une coloration faible ou modérée;
- la coloration de la CLDN18 dans la lamina propria, les lymphocytes, les muscles lisses, les vaisseaux sanguins et le nerf périphérique est nulle.
- Si les témoins positifs sont exempts de coloration, les résultats du test effectué sur le prélèvement sont invalides2
- Les témoins positifs connus ne doivent être utilisés que pour vérifier le bon fonctionnement des réactifs et des instruments; ils ne doivent pas servir à poser un diagnostic particulier sur les échantillons à l’étude2.
Caractéristiques liées au rendement des appareils et des anticorps
Voici des constats tirés d’une étude évaluant la reproductibilité et la comparabilité de trois anticorps dirigés contre la CLDN18 et de systèmes de coloration utilisés en IHC dans une cohorte de 27 laboratoires à l’échelle mondiale4,†,‡:
- Le test VENTANA CLDN18 (43-14A) Assay pour diagnostic in vitro a obtenu un rendement analytique (précision, sensibilité et spécificité) > 95 % reproductible au sein des 27 laboratoires, lorsque comparé à des résultats de référence définis par consensus4.
- L’anticorps de LSBio a obtenu un rendement analytique équivalent à celui du test VENTANA CLDN18 (43-14A) Assay pour diagnostic in vitro, lorsque coloré par les appareils de Dako ou de Leica4.4.
- La coloration de l’anticorps de LSBio était reproductible4.
† Les anticorps pris en compte dans l’étude étaient l’anticorps du test VENTANA CLDN18 (43-14A) Assay pour diagnostic in vitro créé par Roche Tissue Diagnostics, l’anticorps anti-CLDN18 PathPlusTM de LSBio et l’anticorps anti-claudine 18 de Novus Biologicals. Quant aux appareils étudiés, il s’agissait des systèmes de coloration BenchMark ULTRA, Autostainer de Dako et Bond de Leica4.
‡ Les résultats de référence définis par consensus pour tous les anticorps de chaque échantillon ont été déterminés par un examen anatomopathologique centralisé. Le statut de la CLDN18,2 était considéré comme positif si au moins 75 % des cellules tumorales exprimaient la CLDN18 sur leur membrane avec degré de coloration modéré ou élevé (≥ 2+). En ce sens, les anatomopathologistes participants devaient faire part de leur conclusion selon un choix dichotomique (positive ou négative) et fournir une estimation du pourcentage de cellules colorées. Les résultats d’IHC transmis par les laboratoires ont ensuite été comparés au résultat de référence défini par consensus et ont été jugés divergents si les conclusions ne concordaient pas. Une analyse statistique a été réalisée à des fins de comparaison, à laquelle a été appliqué un critère d’acceptation, établi à 85 % (≥ 0,85)4.
CLDN18 : claudine 18; CLDN18,1 : isoforme 1 de la claudine 18; CLDN18,2 : isoforme 2 de la claudine 18; ESMO: European Society for Medical Oncology (Société européenne d’oncologie médicale); FDA: Food and Drug Administration (États-Unis); HER2: human epidermal growth factor receptor 2 (récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain); JOG: jonction œsogastrique; IHC: immunohistochimie
Références: 1. Compton CC, Robb JA, Anderson MW, et al. Preanalytics and precision pathology: pathology practices to ensure molecular integrity of cancer patient biospecimens for precision medicine. Arch Pathol Lab Med. 2019;143(11):1346-63. 2. Ventana CLDN18 (43-14A) assay [notice d’emballage]. Mannheim (Allemagne) : Roche Diagnostics GmbH. 3. Sahin U, Koslowski M, Dhaene K, et al. Claudin-18 splice variant 2 is a pan-cancer target suitable for therapeutic antibody development. Clin Cancer Res. 2008;14(23):7624-34. 4. Jasani B, Schildhaus HU, Taniere P, et al. Global ring study determining reproducibility and comparability of CLDN18 testing assays in gastric cancer. Affiche présentée dans le cadre du congrès de la Société européenne d’oncologie médicale sur les thérapies anticancéreuses ciblées; du 6 au 8 mars 2023, Paris (France). 5. College of American Pathologists. IHC assays—New evidence-based guideline for analytic validation. 1er avril 2014. https://documents.cap.org/documents/ihc-validation-webinar-handout.pdf. Consulté le 30 mars 2023. 6. Société européenne d’oncologie médicale (ESMO). ESMO Gastric Cancer Living Guidelines. Juillet 2023. Accessible au https://www.esmo.org/living-guidelines/esmo-gastric-cancer-living-guideline/diagnosis-pathology-and-molecular-biology/article/diagnosis-pathology-and-molecular-biology. Consulté le 7 septembre 2023.